冠狀病毒在水和廢水中的存活

嚴(yán)重急性呼吸綜合征的出現(xiàn)及其潛在的環(huán)境傳播表明，需要更多關(guān)于冠狀病毒在水和廢水中存活的信息。在過濾和未過濾的自來水(4℃和23℃)和廢水(23℃)中測定了代表性冠狀病毒貓傳染性腹膜炎病毒和人冠狀病毒229E的存活率。在相同的試驗(yàn)條件下，將其與脊髓灰質(zhì)炎病毒1型進(jìn)行了比較。試驗(yàn)水中冠狀病毒的失活高度依賴于溫度、有機(jī)物水平和拮抗細(xì)菌的存在。病毒效價下降99.9% (T99.9)所需的時間表明，在自來水中，冠狀病毒在23℃(10天)水中比在4℃(>100天)水中滅活得更快。冠狀病毒在廢水中迅速死亡，T99.9值在2～4天之間。除了4℃自來水外，脊髓灰質(zhì)炎病毒在所有測試水中的存活時間都比冠狀病毒長。

01介紹

2003年嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)在全世界造成了8000多例病例產(chǎn)生，死亡率約為10% (Manocha et al. 2003;Centers for Disease Control 2004)。最后已知的爆發(fā)是在2004年北京的一個研究實(shí)驗(yàn)室。

這種疾病的原因被確定為一種新的人類冠狀病毒，很可能起源于麝貓，潛在宿主可能是蝙蝠(Guan et al. 2003; Lau et al. 2005; Wang et al. 2006)。冠狀病毒是有包膜的單鏈RNA病毒，大小從60～220納米不等。它們可以感染鳥類和哺乳動物，包括人類，并通過氣溶膠或糞便-口腔途徑傳播。冠狀病毒在爆發(fā)期間的迅速傳播表明，人類冠狀病毒的主要傳播方式是呼吸道飛沫；然而，沒有直接證據(jù)支持這一點(diǎn)(Belshe 1984)。由于迄今為止人類冠狀病毒感染被認(rèn)為是一種溫和的、自我限制的疾病，因此關(guān)于其在環(huán)境中的傳播潛力的信息有限。

鑒于2003年3月在香港高層住宅區(qū)爆發(fā)的涉及300多人的SARS疫情與一個有缺陷的污水系統(tǒng)有關(guān)(Peiris et al. 2003)，SARS疫情傳播可能與水和廢水有關(guān)。SARS-CoV可在腸道內(nèi)復(fù)制 (Leung et al. 2003)，這一事實(shí)使其成為一種可能的腸道病原體，而SARS病例中腹瀉的發(fā)生率在8%～73%之間(SARS流行病學(xué)工作組，2003)，這引起了人們對其潛在環(huán)境傳播的關(guān)注。

Leung等人(2003)還報道，從SARS患者小腸中獲得的病毒培養(yǎng)物產(chǎn)量高于作為該病毒靶器官的肺組織。傳染性病毒是從SARS患者感染后3周內(nèi)的糞便中分離出來的(Chan et al. 2004; Liu et al. 2004)。SARS的出現(xiàn)及其傳播問題表明需要更多的信息，特別是冠狀病毒在水和廢水中的存活情況。本研究比較了代表性冠狀病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒1型在自來水和廢水中的存活情況。

02材料和方法

貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV) (ATCC-990)：一種貓科動物的腸道冠狀病毒，在克蘭德爾里瑟貓腎細(xì)胞系(CRFK) (ATCC-94)中繁殖和檢測。人冠狀病毒229E (HCoV) (ATCC-740)：一種呼吸道病毒，在胎兒肺成纖維細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞系(ATCC-171)中繁殖和分析。脊髓灰質(zhì)炎病毒1 LSc-2ab (PV-1)：一種已知的在環(huán)境中非常穩(wěn)定的人類腸道病毒，在布法羅綠猴腎(BGM)細(xì)胞系中繁殖和檢測。

在單層細(xì)胞中觀察到細(xì)胞致病作用(CPE)后，將感染細(xì)胞在-20℃冷凍和解凍三次以釋放病毒。隨后在1000g離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，加入到9%聚乙二醇(相對分子質(zhì)量8000)和0.5 M氯化鈉的病毒懸浮液中，并在4℃下攪拌過夜。

在10000g離心30分鐘后，用0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS; pH 7.4)(Sigma, St. Louis, MO)重懸至原始病毒懸液體積的5%。然后將冠狀病毒進(jìn)行效價測定并儲存在-80℃下。脊髓灰質(zhì)炎病毒通過用等體積的Vertrel XF (Dupont, Wilmington，DE)提取進(jìn)一步純化，乳化后以7500g離心15分鐘，隨后收集頂層水層，進(jìn)行效價測定并在-80℃儲存。

自來水樣本是從實(shí)驗(yàn)室的冷水龍頭中采集的。水源是地下水，水質(zhì)參數(shù): pH 7.8，溶解固體297mg/L，總有機(jī)碳0.1mg/L。在收集樣品之前，讓水流動3分鐘。在未過濾的自來水和通過0.2μm孔徑過濾器去除細(xì)菌的自來水中測定病毒存活率。

將自來水(30mL)加入到無菌的50mL聚丙烯離心管中，以減少附著在容器上的病毒損失。添加無菌硫代硫酸鈉至最終濃度33μg/mL，以使水脫氯。渦旋后，將病毒添加到每個管中，最終濃度為105 TCID50/mL。再次渦旋離心管并立即取樣(零時間點(diǎn))。然后將離心管儲存在4℃或室溫下(23℃)。室溫下儲存的離心管用鋁箔覆蓋，以防暴露在光線下。在1、3、6、10、15和21天后對離心管取樣，并將樣品在-80℃下冷凍，直到它們在細(xì)胞上被分析。

初級出水和剩余活性污泥(二級)的樣品來自于美國亞利桑那州圖森市羅杰路污水處理廠，并收集在無菌聚丙烯瓶中。沉淀后收集初級出水，氯化前收集二級出水。該設(shè)施一級出水的典型水質(zhì)參數(shù)為生物需氧量(BOD)和1懸浮固體(10～220mg/L)。通常相比初級出水，二級出水中的BOD和懸浮固體減少了90%～95%。

?將出水(30mL)加入到無菌的50mL聚丙烯離心管中。在添加病毒之前，一級出水通過0.2μm孔徑的過濾器過濾，并且未經(jīng)過濾的也進(jìn)行測試。二級出水僅未經(jīng)過濾的進(jìn)行測試。然后將病毒添加到每個離心管中，最終濃度為105 TCID50/mL。將離心管渦旋，立即取樣(零時間點(diǎn))。然后將離心管覆蓋并保持在室溫(23℃)。在1、2、3、6、10、15和21天后收集樣品，并將樣品在-80℃下冷凍直至分析。

使用噬斑試驗(yàn)或TCID50技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)物上計(jì)數(shù)病毒。在6孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板中，通過噬斑測定法(Payment and Trudel 1993)測定了PV-1的效價。這是一種直接定量方法，最低檢測限為10 pfu/mL。

將每種稀釋液接種在兩個孔中。在細(xì)胞培養(yǎng)中不形成斑塊的冠狀病毒，通過組織培養(yǎng)感染劑量50%技術(shù)(TCID50)在24孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板中測定其效價(Payment and Trudel 1993)。這種技術(shù)確定了顯示出CPE的50%的原液的稀釋度。取稀釋倍數(shù)的反對數(shù)，得到每毫升TCID50的病毒效價。

該方法的最低檢測值為每毫升3.7個病毒。將每種稀釋液接種在至少8個孔中。在添加病毒之前，任何來自測試水的樣品都必須在細(xì)胞培養(yǎng)檢測之前過濾，以消除細(xì)菌污染。在pH為7下使3%牛肉提取物(Becton Dick-inson，Sparks，MD)通過以阻斷可能吸附病毒的位點(diǎn)來制備具有聚醚砜(PES)膜的0.2 μm低蛋白結(jié)合Millex過濾器(Millipore, Billerica, MA)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

03結(jié)果和討論

表1顯示了三種病毒在測試水中的存活天數(shù)。每種病毒的對數(shù)減少量由公式“l(fā)g N/N0”計(jì)算，其中N是指定日期的病毒效價，N0是時間為0的病毒效價。線性回歸的斜率用于確定存活率；病毒效價下降99%和99.9%所需的時間(分別表示為T99和T99.9)。

影響病毒在水中存活的因素包括溫度、有機(jī)物和好氧微生物(John and Rose 2005; Melnick and Gerba 1980; Sobsey and Meschke 2003)。對病毒存活關(guān)鍵的影響因素就是溫度。已有研究表明，病毒存活率隨著溫度的升高而降低，這主要是由蛋白質(zhì)變性和胞外酶活性增加引起的(Hurst et al. 1980; John and Rose 2005)。自來水研究的結(jié)果證實(shí)冠狀病毒就是這種情況。通過測試過濾后的自來水，我們減少或消除了顆粒有機(jī)物和細(xì)菌的影響。

在室溫下，只需要10天就能使過濾后的自來水中的冠狀病毒減少99.9%，而在4℃時，這種程度的病毒滅活則需要100天以上。PV-1在自來水中4℃的存活與冠狀病毒相似，但在室溫(23℃)下，該病毒在過濾水和未過濾水中的存活時間都延長了六倍。

水中有機(jī)物和懸浮固體的存在可以為吸附在這些顆粒上的病毒提供保護(hù)，但同時如果這些固體沉淀下來，也可以成為去除病毒的一種機(jī)制。從自來水到二級出水再到一級出水，測試水中的有機(jī)物和懸浮固體含量都有所增加。過濾后的自來水比未過濾的自來水對冠狀病毒滅活作用更強(qiáng)。

此外，HCoV在未過濾的一級出水中的存活時間比過濾后的長。這表明較高的固體含量確實(shí)為水中的冠狀病毒提供了保護(hù)。然而，對PV-1來說，過濾對其在自來水中的存活影響很小。在一級出水中，經(jīng)過濾出水中的PV-1存活時間是未經(jīng)過濾出水中的三倍。

值得注意的是，在添加到廢水中的時間和立即回收用于測試的時間(零時間點(diǎn))之間，冠狀病毒的效價顯著降低。加入廢水后，冠狀病毒的效價立即下降了99.9%，而PV-1效價僅下降了10%。這種減少可能是由于廢水中溶劑和洗滌劑的存在，它們會破壞病毒包膜并最終使病毒失活。

這也可能表明冠狀病毒比PV-1更容易吸附廢水中的固體。病毒包膜的疏水性使得冠狀病毒在水中的溶解性降低，因此增加了這些病毒粘附在固體上的可能性。廢水樣本必須經(jīng)過過濾，以防止細(xì)菌污染細(xì)胞單層，這將去除顆粒物和任何與之相關(guān)的病毒。

捕食性微生物如原生動物的存在可以增加水中病毒的失活率，蛋白酶和核酸酶也有這種作用(Gerba et al. 1978; John and Rose 2005)。與二級出水相比，初級出水的細(xì)菌和固體含量都較高。

所有三種測試病毒在未過濾的初級出水中的存活時間都比未過濾的二級出水長，盡管對FIPV來說這是可以忽略的。這再次表明，廢水中的顆粒物相關(guān)病毒受到保護(hù)，不會被捕食和滅活。然而，冠狀病毒在3天后低于最低檢測限，而PV-1在21天后仍可檢測到。廢水中研究病毒的平均對數(shù)減少結(jié)果列于表2。

04結(jié)論

這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，冠狀病毒比PV-1對溫度更敏感，并且PV-1和冠狀病毒在廢水中的存活性有相當(dāng)大的差異。其部分可能原因是包膜病毒在環(huán)境中不如非包膜病毒穩(wěn)定。冠狀病毒在廢水中很快死亡，在2～3天內(nèi)減少了99.9%，這與SARS-CoV存活數(shù)據(jù)相當(dāng)(Wang et al. 2005a, b)。

冠狀病毒在初級出水中的存活時間僅略長于二級出水，這可能是因?yàn)閼腋」腆w含量較高，可以防止其失活。PV-1比冠狀病毒存活時間長得多，初級出水需要10天，二級出水需要5天，才能達(dá)到與冠狀病毒相當(dāng)?shù)臏缁盥?。本研究表明，冠狀病毒在水環(huán)境中的傳播要比腸道病毒少，因?yàn)樵诃h(huán)境溫度下，冠狀病毒在水中和廢水中會更快地失活。

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